第七节 葡萄糖异构酶.ppt课件

五、酶的筛选

酶的提取是指在一定条件下，用适当的溶剂处理细胞破碎后的含酶原料，使酶充分地溶解到提取液中的过程。酶的提取方法有盐溶液提取法、碱溶液提取法和有机溶剂提取法等。为了提高酶的提取率和防止酶提取后变性失活，提取过程中必须注意保持适宜的温度和pH，并且添加适量的保护剂。提取液中含有多种酶，要想从提取液中分离纯化出某一种酶，必须根据这种酶的特性，选择适合的分离纯化方法。

葡萄糖异构酶主要是胞内酶，可以直接用其菌体，进行反应。提取胞 内酶，首先要破碎细胞 〈破壁、膜〉然后将含有酶活性的部分用过滤 或离心法去除残留细胞和细胞碎片，从而得到澄清溶液。再采用逐步 逐级分离和浓缩等步骤将所得的无细胞提取液纯化。常用破碎处理方法： ◆ 机械破碎法：指利用捣碎机、研磨器或匀浆器等将细胞破碎开来。 ◆ 物理破碎法：指利用温度差、压力差或超声波等将细胞破碎开来。 ◆ 化学破碎法：指利用甲醛、丙酮等有机溶剂或表面活性剂作用于细胞膜， 使细胞膜的结构遭到破坏或透性发生改变。 ◆ 酶学破碎法：指选用合适的酶，使细胞壁遭到破坏，进而在低渗溶液中将 原生质体破碎开来。

酶的提取

葡萄糖异构酶的分离纯化

分子筛

DEAE—FF(离子交换层析的一种， 离子交换树脂为纤维素类)

透析

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IEXC可在中性条件下，利用多肽的带电性不同分离纯化具有生物活性的多肽。其可分为阳离子柱与阴离子柱两大类，还有一些新型树脂，如大孔型树脂、均孔型树脂、离子交换纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶树脂等。 在多肽类物质的分离分析研究中，对多肽的性质、洗脱剂、洗脱条件的研究较多，不同的多肽分离条件有所不同，特别是洗脱剂的离子强度、盐浓度等对纯化影响较大。Wu等报道利用离子交换柱层析法，探讨分离牛碳酸酐异构体和牛血清白蛋白、鸡血清白蛋白酶的提取条件，获得了有价值的数据供今后此类物质分离研究。

离子交换层析

透析在纯化中极为常用，透析膜的截留分子量为5000左右，如分子量小于10000的酶液就有泄露的危险，在纯化中，可除去盐类、有机溶剂、低分子量的抑制剂等。超滤一般用于浓缩和脱色。

不同种类的蛋白质在分子大小方面有一定的差别，用一些简便的方法，使蛋白质混合物得到初步分离。

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提取和分离纯化后的酶制成酶制剂(如将某种酶的酶液进行干燥处理后，加入适量的稳定剂和填充剂)，就可以用来催化化学反应了。 但是，这样的催化反应结束后，酶制剂和产物是混合在一起的，产物的纯度不高，并且酶制剂不能重复使用。为此，科学家设想将分离纯化后的固定到一定的载体上，使用时将被固定的酶投放到反应溶液中，催化反应结束后又能将被固定的酶回收，这样的酶叫做固定化酶。例如，将葡萄糖异构酶吸附到离子交换树脂上，或者包埋在明胶，制成的固定化葡萄糖异构酶，不仅可以用于使葡萄糖转化成甜度更高的高果糖浆、而且可以在生产中反复使用。目前，科学家已经研制出膜状、颗粒状等多种形态的固定化酶。

六、酶的固定化

酶的固定化方法归纳起来有三种：载体结合法、交联法和包埋法。

看懂了吗??

载体结合法： 指将酶固定到非水溶性载体上的方法。 根据固定方式的不同，这种方法可以分为物理吸附法、离子结合法和共价结合法。 物理吸附法是指将酶吸附到固体吸附剂表面的方法，固体吸附剂多为活性碳、多孔玻璃等。 离子结合法是指通过离子键将酶结合到具有离子交换基团的非水溶性载体上的方法，载体有离子交换树脂等。 共价结合法是指酶和载体以共价键的形式结合在一起的方法，这种方法需要酶和载体都具有氨基、羧基或羟基等官能团。

交联法： 指通过双功能试剂，将酶和酶联结成网状结构的方法。交联法使用的交联剂 是戊二醛等水溶性化合物。

包埋法： 指将酶包裹在多孔的载体中，如将酶包裹在聚丙烯酰胺凝胶等高分子凝胶中，或包裹在硝酸纤维素等半透性高分子膜中。前者包埋成格子型，后者包埋成微胶囊型。

现在国内普遍采用的是钼铵酸显色和半胱氨酸—-咔唑法，这些方法的优点是灵敏度高。现象直接，用肉眼可以粗略辨别酶活大小，但所用试剂多，易受环境温度的影响，特别是后者需在浓硫酸存在下显色，对实验者和一起易造成损伤。因此，有必要建立新的简便快速的检测酶活的手段。

七、酶活力的测定方法

比色法测酶活